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K599发根农杆菌的注意事项及应用

K599发根农杆菌的注意事项及应用
2022-11-16
 一、菌种简介:

  土壤发根农杆菌(Ag.rhizogenes)是一种侵染性非常广泛的土壤细菌,能侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物而诱发发根瘤。这是由其所携带的Ri质粒(Rootinducingplasmid)所引起的。Ri质粒上含有负责发根瘤自主性生长和冠瘿碱合成的基因。在结构上,与Ti质粒相似,它主要具有Vir区、T-DNA区及其内的冠瘿碱合成功能区等。

  菌种名称:发根农杆菌K599

  平台编号:zl-059686


  规格:2ml甘油菌

  抗性:Rif+Spc

  培养基:YEB

  菌株类别:农杆菌

  培养条件:28℃,有氧,YEB

  质粒转化:电转、化转

  保存方式:30%甘油,-20℃

  基本应用:转基因

  二、注意事项:

  1、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。本产品仅可用于实验室研究,不能用于动物,人体以及作为食品添加剂等用途。

  2、使用本产品的甘油菌时可以不用完全融解,在甘油菌表面蘸取少量涂布固体琼脂平板即可,也可以完全融解后使用,但随着冻融次数的增加,菌株的活力会逐渐下降。

  三、应用

  1.用于获得转基因植物和培育作物新品种

  对Ri质粒T-DNA进行改造,可以构建出新的具有目的基因和标记基因的Ri质粒,用改造型Ri质粒的发根农杆菌感染植物细胞,可以将目的基因导入植物组织,并可再生出转基因植物,所以发根农杆菌为遗传工程改良植物抗性和品质提供了一条十分有效的途径。1985年,Ooms等用发根农杆菌转化甘蓝型油菜的子叶,得到转基因油菜,其皱叶等异常表型可以遗传。同年,Arlette等用发根农杆菌Ri质粒的T-DNA转化胡萝卜,烟草,牵牛等植物叶片,从遗传转化的毛根再生出完整植株。Comai等用含沙门氏杆菌aroA基因的pRiA4的TL-DNA的发根农杆菌转化烟草,获得耐草甘膦(Glyphosate)的转基因植株。Robaglia等用含nptⅡ基因的中间载体的发根农杆菌转化烟草,获得抗卡那霉素的转化根与再生植株。1989年,何玉科用发根农杆菌转化甘蓝型油菜等作物,获得了含其T-DNA的转化根;用发根农杆菌LBA9402的遗传转化作用,从甘蓝下胚轴切段诱导出含T-DNA的转化根,并由其再生出小植株。1988年,张荫麟用发根农杆菌15834感染赛莨菪叶片,获得产生生物碱的转化根;1992年,他又用发根农杆菌感染金荞麦无菌苗,诱导出发根。1999年,王冲之等用发根农杆菌15834感染西洋参无菌苗切段获得发根,PCR分析证实ro1C序列整合入转化植株的染色体组。

  2.用于生产次生代谢产物

  利用植物细胞培养技术生产次生代谢物真正实现商品化生产的还为数甚少,其主要原因在于植物细胞生长缓慢,有些还需要激素维持,次生代谢物含量太低,以及生产能力不稳定等,因而工业化生产的成本太高。发根能合成植物特征的次生代谢产物,而且其含量往往比植物的含量还高,尤其是它的稳定性和生长迅速的特点是工业化生产所梦寐以求的,因此发根培养技术将成为次生代谢产物生产的一条可靠和有效途径。国外在这方面的研究较为深入,大都从大规模生产及其生产工艺入手,国内这方面的研究起步较晚,但也取得了一些成就。

  人参悬浮培养细胞及再生根中人参皂甙含量较高,但由于其生长需激素维持,因而不能作为药品上市,Yoshikawa和Furuya通过人参愈伤组织诱导出发根,在无外源激素的条件下,人参皂甙(Rb和Rg)含量高达干重的0.95%,高于再生根(0.91%)和天然栽培根(0.4%)。Shimomura等诱导紫草再生植株产生的发根在2L气升式反应器中生长迅速,每天可回收5mg紫草色素,且可连续生产220d。天花粉蛋白是由多年生栝楼的块根制成,近年来的研究表明天花粉蛋白能够选择性地抑制爱滋病病毒HIV的复制,并能抑制绒毛膜上皮癌细胞的生长,从地下挖取块根势必会造成资源浪费,邱德有等用发根农杆菌R1601建立了栝楼发根的离体培养系统,每克鲜重栝楼发根中天花粉蛋白的含量达8.16mg;紫杉醇是从红豆杉属植物树皮和针叶中分离的一种四环二萜酰胺类化合物,被称为是过去几十年中发现的最好的抗癌药物,紫杉醇在植物体中的含量极低,国内外许多实验室都在开展利用发根生产紫杉醇的研究,由于紫杉醇的市场潜力很大,许多研究结果没有公开发表,黄遵锡等报道了发根农杆菌A4对短叶红豆杉芽外植体的转化,并检测到发根中紫杉醇的含量为愈伤组织的1.3-8.0倍,且发根在悬浮培养过程中,还可向培养液中分泌0.01-0.03mg/L的紫杉醇;长春碱的长春新碱是存在于长春花中的具有抗癌作用的双体吲哚生物碱,Parr等通过诱导长春花形成发根,从发根中检测到了长春碱;Tada等用发根农杆菌诱导芳香植物罗勒获得的发根培养物在无激素的培养基上生长良好并积累rosmarinicacid,而相关的酚类化合物很少;1997年,Laurain等用发根农杆菌A4感染银杏雌性原叶体获得转化胚芽,用高压液相色谱检测转化胚芽的细胞培养物中银杏苦内酯和白果内酯的浓度高达0.087%(干重),高于未转化的同源细胞培养物(0.065%);Kittipongpatana等发现SolanumaviculareForst的发根中澳洲茄胺的含量高达6.2mg/g(干重),高于愈伤组织(1.4mg/g)和细胞悬液(0.7mg/g);Inokova等发现不同菌株对紫云英无菌苗诱导发根的能力、发根生长速度、皂苷的产量均有影响,转化根在没有硝酸铵和植物激素的MS培养基上生长良好,培养基中加入谷固醇后,皂苷产量有明显增加;Tana-ka等用发根农杆菌感染风铃草获得转化根,发现转化根中产生3-葡萄苷花青素、3-芸香苷花青素及黄酮类化合物等,同时还发现光照和BA有助于花青素的积累;Yu和Kanokwaree等还研究了氧气对颠茄发根生长的影响。刘春朝和刘本叶等对青蒿发根青蒿素的培养条件和生物合成动态进行了研究;郑志和等对黄芪发根的大量培养和发根中化学成分及免疫功能活性进行了研究。这些实验表明,亲本植株能合成的次生代谢物可用发根培养物来生产,因而被认为是一条利用生物技术生产次生代谢物(如药物、天然色素、香料、天然调味品等)的新的有效途径,可以说这一技术的出现是次生代谢物研究领域中的一次重大事件。

  3.促使植物生根

  Ri质粒能诱导转化植物产生大量毛根,促进植物生根,已引起了人们的高度重视,被人们广泛使用。1985年它被应用于苹果与扁桃的插条以改善生根状况,从而有益于对干旱的抵抗。Hatta等发现发根农杆菌能诱导枣树的插条生根,Caboni等用野生发根农杆菌1855感染胡桃的微小切口,诱导出发根;Rinallo等发现发根农杆菌的T-DNA能促进榆树生根。Ri质粒的这一特性对于难生根植物生根、存活具有重要意义。

  4.用于生产外源基因产物

  另外,还可以用Ri质粒作为载体通过发根农杆菌向植物基因插入外源基因生产外源基因产品,Stougaaard等用含大豆血红蛋白基因的农杆碱型质粒pRi15834(中间载体)诱发牛角花产生毛根,并由毛根获得基因表达的再生植株。发根培养技术的发展历史虽然较短,但Ri质粒作为植物基因工程载体已显示出其可行性与方便性,随着研究的深入,它将会成为比Ti质粒更理想的基因转移系统,更多的次生代谢物将会通过发根培养系统来生产,并被用于难以插活植物的生根和生产外源基因产品。
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